FRET
FRET gewinnt als Methode zur Bestimmung von Abständen auf molekularer Ebene und zur Untersuchung dynamischer Prozesse wie der Bindung von Antikörper/Antigen-Paaren zunehmend an Bedeutung.
Wenn sich zwei Farbstoffmoleküle nahe beieinander befinden, können ihre Übergangsdipole interagieren und Energie strahlungslos von einem Farbstoffmolekül (Donor) auf das andere (Akzeptor) übertragen werden.
Die Rate der Energieübertragung kET entspricht nach der Förster-Theorie:
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NA Avogadro-Konstante
n Brechungsindex des Lösungsmittels
τ0 strahlende Zerfallszeit des Donors
r Abstand zwischen Donor und Akzeptormolekül
F(λ) Fluoreszenzspektrum des Donors, normiert nach
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ε(λ) molarer dekadischer Extinktionskoeffizient des Akzeptors
κ2 Orientierungsfaktor: κ2 = (cosφDA - 3 cosφD cosφA)2
φDA Winkel zwischen den Übergangsdipolen von Donor und Akzeptor
φD Winkel zwischen Donor-Übergangsdipol und der Verbindungslinie der beiden Dipole
φA Winkel zwischen Akzeptor-Übergangsdipol und der Verbindungslinie der beiden Dipole
Wie aus der Formel ersichtlich ist, nimmt die Rate der Energieübertragung mit der 6. Potenz des Abstands zwischen den Farbstoffmolekülen ab. FRET ist nur dann sehr effizient, wenn sich Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe befinden. Bei typischen Farbstoffmolekülen wird FRET bei Abständen über 100 Å (10 nm) vernachlässigbar klein. Darüber hinaus ist die Rate proportional zum Extinktionskoeffizienten des Akzeptorfarbstoffs im Wellenlängenbereich der Donorfluoreszenz (Überlappungsintegral J):
FRET ist am effizientesten, wenn es eine gute spektrale Überlappung zwischen der Fluoreszenz des Donors und der Absorption des Akzeptors gibt.
Ein Beispiel für die Effizienz der Energieübertragung liefert die Click-Reaktion von ATTO 565-DBCO mit ATTO 633-Azid. Dabei bildet sich ein „Doppelmolekül“, bei dem die beiden Chromophore über einen Triazol-Ring miteinander gekoppelt sind:
Verfolgt man diese Reaktion Fluoreszenz-spektroskopisch, so kann man zu Beginn der Reaktion feststellen, dass beide Reaktionspartner räumlich getrennt und unabhängig voneinander vorliegen: Bei einer Anregungswellenlänge von 560 nm erhält man das Fluoreszenzspektrum von ATTO 565-DBCO (- - -) während man bei 628 das Fluoreszenzspektrum von ATTO 633-Azid (- - -) detektiert.
Nach erfolgter Reaktion sind die beiden Chromophore durch den Linker miteinander verbunden und kommen sich so nahe, dass eine beinahe vollständige Übertragung der Anregungsenergie durch den FRET-Mechanismus stattfindet: Bei einer Anregung bei 560 nm detektiert man nun das Fluoreszenzspektrum von ATTO 633; erst in der Vergrößerung erkennt am Fuß der Bande (neben dem Anregungspeak) noch einen geringen Anteil der Fluoreszenz von ATTO 565.
Ein häufig verwendetes Maß für die FRET-Effizienz ist der Abstand, bei dem die Rate kET des Energietransfers der Rate der Donorfluoreszenz entspricht.
Dieser sogenannte Förster-Radius R0 ist gegeben durch:
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ηfl Fluoreszenz-Quantenausbeute des Donors, ηfl = τfl / τ0
τfl Fluoreszenzabklingzeit des Donors
Eine Tabelle der Förster-Radien (R0) für ATTO-Farbstoffe finden Sie im Abschnitt "Support".
Review-Artikel zu FRET-Anwendungen in den Lebenswissenschaften:
E. A. Jares-Erijman, T.M. Jovin, FRET imaging, Nature biotechnology 21, 1387 (2003).
S.-H.Cheng, N.-T. Chen, C.-Y. Wu, C.-Y. Chung, Y. Hwu, C.-Y. Mou et al., Recent Advances in Dynamic Monitoring of Drug Release of Nanoparticle Using Förster Resonance Energy Transfer and Fluorescence Lifetime Imaging, J. Chinese Chemical Soc. 58, 798 (2011).
A. Gust, A. Zander, A. Gietl, P. Holzmeister, S. Schulz, B. Lalkens et al., A Starting Point for Fluorescence-Based Single-Molecule Measurements in Biomolecular Research, Molecules 19, 15824 (2014).
In der Literatur werden u.a. folgende Donor/Akzeptor-Kombinationen von ATTO-Labeln empfohlen:
ATTO 425 – ATTO 520
ATTO 488 – ATTO 550, ATTO 565, ATTO 647N, ATTO 655
ATTO 520 – ATTO 647N
ATTO 532 – ATTO 647N, ATTO 655
ATTO 550 – ATTO 590, ATTO 647N
ATTO 565 – ATTO 590, ATTO 647N
ATTO 590 – ATTO 620, ATTO 647N, ATTO 680
ATTO 620 – ATTO 680
Ausgewählte Literatur mit ATTO-Farbstoffen:
B. Hellenkamp, S. Schmid, O. Doroshenko, O. Opanasyuk, R. Kühnemuth, J. Michaelis, C.A.M. Seidel, T.D. Craggs, T. Hugel et al., Precision and accuracy of single-molecule
FRET measurements - a multi-laboratory benchmark study. Nat Meth 15 (9), 669 (2018). → ATTO 550 – ATTO 647N
A. Auer, M. T. Strauss, T. Schlichthaerle, R. Jungmann: Fast, Background-Free DNAPAINT Imaging Using FRET-Based Probes, Nano letters 17 (10), 6428 (2017). → ATTO 488 – ATTO 647N
F. Castello, J. M. Paredes, M. J. Ruedas-Rama, M. Martin, M. Roldan, S. Casares, A. Orte, Two-Step Amyloid Aggregation. Sequential Lag Phase Intermediates, Scientific Reports 7, 40065 (2017). → ATTO 488 – ATTO 647N
U. S. Chio, S. Chung, S. Weiss, S. Shan, A protean clamp guides membrane targeting of tail-anchored proteins, PNAS 114 (41), E8585 (2017). → ATTO 550 – ATTO 647N
J. Funke, H. Dietz, Placing molecules with Bohr radius resolution using DNA origami, Nature Nanotech 11 (1), 47 (2016). → ATTO 550 – ATTO 647N
A. Andreoni, L. Nardo, R. Rigler, Time-resolved homo-FRET studies of biotin-streptavidin complexes. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 162, 656 (2016).
→ ATTO 550 (homo-FRET)
P. Ghenuche, J. de Torres, S.B. Moparthi, V. Grigoriev, J. Wenger, Nanophotonic Enhancement of the Förster Resonance Energy-Transfer Rate with Single Nanoapertures.
Nano letters 14 (8), 4707 (2014). → ATTO 550 – ATTO 647N
J. List, M. Weber, F. C. Simmel, Hydrophobic Actuation of a DNA Origami Bilayer Structure, Angew. Chem. Int. Ed. 53, 4236 (2014). → ATTO 532 – ATTO 647N
H. Höfig, M. Gabba, S. Poblete, D. Kempe, J. Fitter, Inter-Dye Distance Distributions Studied by a Combination of Single-Molecule FRET-Filtered Lifetime Measurements and
a Weighted Accessible Volume (wAV) Algorithm, Molecules 19, 19269 (2014). → ATTO 488 – ATTO 655
T. E. Tomov, R. Tsukanov, M. Liber, R. Masoud, N. Plavner, E. Nir, Rational Design of DNA Motors: Fuel Optimization through Single-Molecule Fluorescence, J. Am. Chem. Soc. 135, 11935 (2013). → ATTO 550 – ATTO 647N
E. Lerner, G. Hilzenrat, D. Amir, E. Tauber, Y. Garini, E. Haas, Preparation of homogeneous samples of double-labelled protein suitable for single-molecule FRET measurements, Anal. Bioanal. Chem. 405, 5983 (2013). → ATTO 488 – ATTO 647N
S. Winterfeld, S. Ernst, M. Börsch, U. Gerken, A. Kuhn, Real Time Observation of Single Membrane Protein Insertion Events by the Escherichia coli Insertase YidC, PLoS ONE 8, e59023 (2013). → ATTO 520 – ATTO 647N
S.L. Kuan, D.Y.W. Ng, Y. Wu, C. Förtsch, H. Barth, M. Doroshenko, K. Koynov, C. Meier, T. Weil, pH Responsive Janus-like Supramolecular Fusion Proteins for Functional Protein Delivery, J. Am. Chem. Soc. 135, 17254 (2013). → ATTO 425 – ATTO 520
R. Bienert, B. Zimmermann, V. Rombach-Riegraf, P. Gräber, Time-Dependent FRET with Single Enzymes: Domain Motions and Catalysis in H+-ATP Synthases, ChemPhysChem, 12, 510 (2013). → ATTO 532 – ATTO 655
K. Seyfert, T. Oosaka, H. Yaginuma, S. Ernst, H. Noji, R. Iino, M. Börsch, Subunit rotation in a single FoF1-ATP synthase in living bacterium monitored by FRET, Proc. SPIE 7905, 79050K-9 (2011). → ATTO 565 – ATTO 590 – ATTO 647N
L. Marcon, C. Spriet, T. D. Meehan, B. J. Battersby, G. A. Lawrie, L. Héliot, M. Trau, Synthesis and Application of FRET Nanoparticles in the Profiling of a Protease, Small 5, 2053 (2009). → ATTO 488 – ATTO 550 – ATTO 590
Wenn sich zwei Farbstoffmoleküle nahe beieinander befinden, können ihre Übergangsdipole interagieren und Energie strahlungslos von einem Farbstoffmolekül (Donor) auf das andere (Akzeptor) übertragen werden.
Die Rate der Energieübertragung kET entspricht nach der Förster-Theorie:
NA Avogadro-Konstante
n Brechungsindex des Lösungsmittels
τ0 strahlende Zerfallszeit des Donors
r Abstand zwischen Donor und Akzeptormolekül
F(λ) Fluoreszenzspektrum des Donors, normiert nach
ε(λ) molarer dekadischer Extinktionskoeffizient des Akzeptors
κ2 Orientierungsfaktor: κ2 = (cosφDA - 3 cosφD cosφA)2
φDA Winkel zwischen den Übergangsdipolen von Donor und Akzeptor
φD Winkel zwischen Donor-Übergangsdipol und der Verbindungslinie der beiden Dipole
φA Winkel zwischen Akzeptor-Übergangsdipol und der Verbindungslinie der beiden Dipole
Wie aus der Formel ersichtlich ist, nimmt die Rate der Energieübertragung mit der 6. Potenz des Abstands zwischen den Farbstoffmolekülen ab. FRET ist nur dann sehr effizient, wenn sich Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe befinden. Bei typischen Farbstoffmolekülen wird FRET bei Abständen über 100 Å (10 nm) vernachlässigbar klein. Darüber hinaus ist die Rate proportional zum Extinktionskoeffizienten des Akzeptorfarbstoffs im Wellenlängenbereich der Donorfluoreszenz (Überlappungsintegral J):
FRET ist am effizientesten, wenn es eine gute spektrale Überlappung zwischen der Fluoreszenz des Donors und der Absorption des Akzeptors gibt.
Ein Beispiel für die Effizienz der Energieübertragung liefert die Click-Reaktion von ATTO 565-DBCO mit ATTO 633-Azid. Dabei bildet sich ein „Doppelmolekül“, bei dem die beiden Chromophore über einen Triazol-Ring miteinander gekoppelt sind:
Verfolgt man diese Reaktion Fluoreszenz-spektroskopisch, so kann man zu Beginn der Reaktion feststellen, dass beide Reaktionspartner räumlich getrennt und unabhängig voneinander vorliegen: Bei einer Anregungswellenlänge von 560 nm erhält man das Fluoreszenzspektrum von ATTO 565-DBCO (- - -) während man bei 628 das Fluoreszenzspektrum von ATTO 633-Azid (- - -) detektiert.
Nach erfolgter Reaktion sind die beiden Chromophore durch den Linker miteinander verbunden und kommen sich so nahe, dass eine beinahe vollständige Übertragung der Anregungsenergie durch den FRET-Mechanismus stattfindet: Bei einer Anregung bei 560 nm detektiert man nun das Fluoreszenzspektrum von ATTO 633; erst in der Vergrößerung erkennt am Fuß der Bande (neben dem Anregungspeak) noch einen geringen Anteil der Fluoreszenz von ATTO 565.
Ein häufig verwendetes Maß für die FRET-Effizienz ist der Abstand, bei dem die Rate kET des Energietransfers der Rate der Donorfluoreszenz entspricht.
Dieser sogenannte Förster-Radius R0 ist gegeben durch:
ηfl Fluoreszenz-Quantenausbeute des Donors, ηfl = τfl / τ0
τfl Fluoreszenzabklingzeit des Donors
Eine Tabelle der Förster-Radien (R0) für ATTO-Farbstoffe finden Sie im Abschnitt "Support".
Review-Artikel zu FRET-Anwendungen in den Lebenswissenschaften:
E. A. Jares-Erijman, T.M. Jovin, FRET imaging, Nature biotechnology 21, 1387 (2003).
S.-H.Cheng, N.-T. Chen, C.-Y. Wu, C.-Y. Chung, Y. Hwu, C.-Y. Mou et al., Recent Advances in Dynamic Monitoring of Drug Release of Nanoparticle Using Förster Resonance Energy Transfer and Fluorescence Lifetime Imaging, J. Chinese Chemical Soc. 58, 798 (2011).
A. Gust, A. Zander, A. Gietl, P. Holzmeister, S. Schulz, B. Lalkens et al., A Starting Point for Fluorescence-Based Single-Molecule Measurements in Biomolecular Research, Molecules 19, 15824 (2014).
In der Literatur werden u.a. folgende Donor/Akzeptor-Kombinationen von ATTO-Labeln empfohlen:
ATTO 425 – ATTO 520
ATTO 488 – ATTO 550, ATTO 565, ATTO 647N, ATTO 655
ATTO 520 – ATTO 647N
ATTO 532 – ATTO 647N, ATTO 655
ATTO 550 – ATTO 590, ATTO 647N
ATTO 565 – ATTO 590, ATTO 647N
ATTO 590 – ATTO 620, ATTO 647N, ATTO 680
ATTO 620 – ATTO 680
Ausgewählte Literatur mit ATTO-Farbstoffen:
B. Hellenkamp, S. Schmid, O. Doroshenko, O. Opanasyuk, R. Kühnemuth, J. Michaelis, C.A.M. Seidel, T.D. Craggs, T. Hugel et al., Precision and accuracy of single-molecule
FRET measurements - a multi-laboratory benchmark study. Nat Meth 15 (9), 669 (2018). → ATTO 550 – ATTO 647N
A. Auer, M. T. Strauss, T. Schlichthaerle, R. Jungmann: Fast, Background-Free DNAPAINT Imaging Using FRET-Based Probes, Nano letters 17 (10), 6428 (2017). → ATTO 488 – ATTO 647N
F. Castello, J. M. Paredes, M. J. Ruedas-Rama, M. Martin, M. Roldan, S. Casares, A. Orte, Two-Step Amyloid Aggregation. Sequential Lag Phase Intermediates, Scientific Reports 7, 40065 (2017). → ATTO 488 – ATTO 647N
U. S. Chio, S. Chung, S. Weiss, S. Shan, A protean clamp guides membrane targeting of tail-anchored proteins, PNAS 114 (41), E8585 (2017). → ATTO 550 – ATTO 647N
J. Funke, H. Dietz, Placing molecules with Bohr radius resolution using DNA origami, Nature Nanotech 11 (1), 47 (2016). → ATTO 550 – ATTO 647N
A. Andreoni, L. Nardo, R. Rigler, Time-resolved homo-FRET studies of biotin-streptavidin complexes. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 162, 656 (2016).
→ ATTO 550 (homo-FRET)
P. Ghenuche, J. de Torres, S.B. Moparthi, V. Grigoriev, J. Wenger, Nanophotonic Enhancement of the Förster Resonance Energy-Transfer Rate with Single Nanoapertures.
Nano letters 14 (8), 4707 (2014). → ATTO 550 – ATTO 647N
J. List, M. Weber, F. C. Simmel, Hydrophobic Actuation of a DNA Origami Bilayer Structure, Angew. Chem. Int. Ed. 53, 4236 (2014). → ATTO 532 – ATTO 647N
H. Höfig, M. Gabba, S. Poblete, D. Kempe, J. Fitter, Inter-Dye Distance Distributions Studied by a Combination of Single-Molecule FRET-Filtered Lifetime Measurements and
a Weighted Accessible Volume (wAV) Algorithm, Molecules 19, 19269 (2014). → ATTO 488 – ATTO 655
T. E. Tomov, R. Tsukanov, M. Liber, R. Masoud, N. Plavner, E. Nir, Rational Design of DNA Motors: Fuel Optimization through Single-Molecule Fluorescence, J. Am. Chem. Soc. 135, 11935 (2013). → ATTO 550 – ATTO 647N
E. Lerner, G. Hilzenrat, D. Amir, E. Tauber, Y. Garini, E. Haas, Preparation of homogeneous samples of double-labelled protein suitable for single-molecule FRET measurements, Anal. Bioanal. Chem. 405, 5983 (2013). → ATTO 488 – ATTO 647N
S. Winterfeld, S. Ernst, M. Börsch, U. Gerken, A. Kuhn, Real Time Observation of Single Membrane Protein Insertion Events by the Escherichia coli Insertase YidC, PLoS ONE 8, e59023 (2013). → ATTO 520 – ATTO 647N
S.L. Kuan, D.Y.W. Ng, Y. Wu, C. Förtsch, H. Barth, M. Doroshenko, K. Koynov, C. Meier, T. Weil, pH Responsive Janus-like Supramolecular Fusion Proteins for Functional Protein Delivery, J. Am. Chem. Soc. 135, 17254 (2013). → ATTO 425 – ATTO 520
R. Bienert, B. Zimmermann, V. Rombach-Riegraf, P. Gräber, Time-Dependent FRET with Single Enzymes: Domain Motions and Catalysis in H+-ATP Synthases, ChemPhysChem, 12, 510 (2013). → ATTO 532 – ATTO 655
K. Seyfert, T. Oosaka, H. Yaginuma, S. Ernst, H. Noji, R. Iino, M. Börsch, Subunit rotation in a single FoF1-ATP synthase in living bacterium monitored by FRET, Proc. SPIE 7905, 79050K-9 (2011). → ATTO 565 – ATTO 590 – ATTO 647N
L. Marcon, C. Spriet, T. D. Meehan, B. J. Battersby, G. A. Lawrie, L. Héliot, M. Trau, Synthesis and Application of FRET Nanoparticles in the Profiling of a Protease, Small 5, 2053 (2009). → ATTO 488 – ATTO 550 – ATTO 590