Farbstoffauswahl
Um die bestmöglichen Ergebnisse mit einem Fluoreszenzmarker zu erzielen, müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden.
Erstens ist dies die Anregungslichtquelle: Um eventuelle Störungen durch die Autofluoreszenz der Probe zu reduzieren, ist eine Anregungswellenlänge über 550 nm oder sogar 600 nm vorzuziehen. Neben dem reduzierten Untergrund ist der rote Spektralbereich auch bei der Arbeit mit lebenden Zellen von Vorteil, da Schädigungen verringert werden.
Zweitens sollte das Fluoreszenzlabel eine starke Absorption bei der Anregungswellenlänge sowie eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute aufweisen. Das Produkt aus Extinktionskoeffizient und Fluoreszenzquantenausbeute wird oft als "Brightness" (engl. „Helligkeit“) eines Farbstoffs bezeichnet.
Die Fluoreszenzeffizienz von Farbstoffen ist im blauen und grünen Bereich des Spektrums am höchsten. Hier erreicht die Quantenausbeute in einigen Fällen fast die theoretische Grenze von 100 %. Zu längeren Wellenlängen hin sinkt die Quantenausbeute der Emission drastisch, insbesondere in wässriger Lösung. ATTO-TEC ist es jedoch gelungen, Fluoreszenzlabel zu entwickeln, die eine hohe Quantenausbeute auch bei 650 nm aufweisen. Zum Beispiel fluoresziert ATTO 647N in wässriger Lösung doppelt so stark wie der ältere Cyaninfarbstoff Cy5TM.
Relative Fluoreszenzintensitäten von ATTO 647N und Cy5TM. Wässrige Lösung in PBS mit einer
Extinktion von 0,04 am jeweiligen Absorptionsmaximum in einer 1 cm Zelle. Anregung der Fluoreszenz
im Schnittpunkt beider Absorptionsspektren (gleiche Absorption) bei 22 °C.
Schließlich sollte das Emissionsspektrum des Markers mit der Transmission des verwendeten Filtersatzes übereinstimmen. Der Filtersatz wiederum muss so gewählt werden, dass er von der Probe gestreutes Anregungslicht ausblendet und die Fluoreszenz so effektiv wie möglich durchlässt.
Bei der Verwendung eines Diodenlasers der Wellenlänge 635 nm als Anregungsquelle und eines Filtersets mit hoher Durchlässigkeit zwischen 650 nm und 750 nm wäre beispielsweise der ATTO 647N eine sehr gute Wahl. Wie aus der Liste der ATTO-Farbstoffe ersichtlich ist, weist ATTO647N einen hohen Extinktionskoeffizienten bei 635 nm, einer Wellenlänge nahe dem Maximum der Absorptionskurve sowie eine ausgezeichnete Quantenausbeute der Fluoreszenz (ηfl = 65 %) auf.
Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über einige häufig verwendete Anregungsquellen und empfohlene ATTO-Label.
Eigenschaften von Fluoreszenzmarkern
Es ist jedoch zu beachten, dass neben den bereits diskutierten optischen Überlegungen auch andere Faktoren bei der Auswahl eines Labels wichtig sein können, z.B. pH-abhängige optische und chemische Eigenschaften des Farbstoffs, seine Löslichkeit, Photo- und chemische Stabilität, die Größe des Chromophors oder Länge des Linkers etc., die die Anforderungen an die jeweilige Anwendung betreffen bzw. erfüllen. Diese Eigenschaften können für die Eignung von Farbstoffen als Fluoreszenzmarker sehr relevant sein.
Am wichtigsten ist, dass der Farbstoff während der Bestrahlung intakt bleibt. Viele gängige Label, wie z.B. das Fluoresceinderivat FITC, weisen eine sehr geringe Lichtstabilität auf. Infolgedessen sind Empfindlichkeit und Qualität der Bildgebung bei Verwendung hochintensiver Laseranregung begrenzt wenn Prozesse über einen längeren Zeitraum beobachtet werden. Dies ist ein gravierender Nachteil bei der Mikroskopie und anderen Techniken, die auf dem konfokalen Prinzip basieren, wie z.B. bei der Detektion von einzelnen Zellen. Im Gegensatz zu einigen weit verbreiteten älteren Farbstoffen sind die neuen patentierten ATTO-Label so konzipiert, dass sie auch bei längerer Bestrahlung wesentlich stabiler sind.
Photostabilität von ATTO 655 im Vergleich zu herkömmlichem Cy5TM in Wasser.
Bestrahlung mit einer 250 W Wolfram-Halogenlampe, fokussiert in eine 1 cm Zelle.
Extinktion vs. Bestrahlungsdauer.
Viele gängige Fluoreszenzmarker zersetzen sich auch ohne Bestrahlung (d.h. im Dunkeln), insbesondere wenn sie kleinen Ozonkonzentrationen in der Laboratmosphäre ausgesetzt sind. Unter identischen Bedingungen der Ozonbelastung sind die Farbstoffe ATTO 647N und ATTO 655 bis zu 100-mal länger stabil als die Cyaninfarbstoffe Cy5TM und Alexa647TM. Dies ist sehr wichtig bei Microarray-Anwendungen, bei denen sich die Farbstoffmoleküle auf der Oberfläche befinden und somit direkt der Atmosphäre ausgesetzt sind.
Kompakte und leistungsstarke Laserdioden decken heute den gesamten sichtbaren und nahen infraroten Teil des Spektrums ab. Sie fanden ihren Weg in viele Anwendungen/Geräte als sehr effiziente Anregungsquellen und ersetzen immer mehr klassische Lichtquellen.
Steht kein Label mit einem Absorptionsmaximum zur Verfügung, das genau der Wellenlänge der vorhandenen Anregungsquelle entspricht, sollte ein Farbstoff mit etwas längerer Wellenlänge gewählt werden. Die Absorption wird dann etwas geringer sein, aber der größere Unterschied zwischen Anregungswellenlänge und dem Fluoreszenzspektrum, welches unabhängig von der Anregungswellenlänge ist, hat bei der Detektion den Vorteil einer besseren Abtrennung von gestreutem Anregungslicht.
Erstens ist dies die Anregungslichtquelle: Um eventuelle Störungen durch die Autofluoreszenz der Probe zu reduzieren, ist eine Anregungswellenlänge über 550 nm oder sogar 600 nm vorzuziehen. Neben dem reduzierten Untergrund ist der rote Spektralbereich auch bei der Arbeit mit lebenden Zellen von Vorteil, da Schädigungen verringert werden.
Zweitens sollte das Fluoreszenzlabel eine starke Absorption bei der Anregungswellenlänge sowie eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute aufweisen. Das Produkt aus Extinktionskoeffizient und Fluoreszenzquantenausbeute wird oft als "Brightness" (engl. „Helligkeit“) eines Farbstoffs bezeichnet.
Die Fluoreszenzeffizienz von Farbstoffen ist im blauen und grünen Bereich des Spektrums am höchsten. Hier erreicht die Quantenausbeute in einigen Fällen fast die theoretische Grenze von 100 %. Zu längeren Wellenlängen hin sinkt die Quantenausbeute der Emission drastisch, insbesondere in wässriger Lösung. ATTO-TEC ist es jedoch gelungen, Fluoreszenzlabel zu entwickeln, die eine hohe Quantenausbeute auch bei 650 nm aufweisen. Zum Beispiel fluoresziert ATTO 647N in wässriger Lösung doppelt so stark wie der ältere Cyaninfarbstoff Cy5TM.
Relative Fluoreszenzintensitäten von ATTO 647N und Cy5TM. Wässrige Lösung in PBS mit einer
Extinktion von 0,04 am jeweiligen Absorptionsmaximum in einer 1 cm Zelle. Anregung der Fluoreszenz
im Schnittpunkt beider Absorptionsspektren (gleiche Absorption) bei 22 °C.
Schließlich sollte das Emissionsspektrum des Markers mit der Transmission des verwendeten Filtersatzes übereinstimmen. Der Filtersatz wiederum muss so gewählt werden, dass er von der Probe gestreutes Anregungslicht ausblendet und die Fluoreszenz so effektiv wie möglich durchlässt.
Bei der Verwendung eines Diodenlasers der Wellenlänge 635 nm als Anregungsquelle und eines Filtersets mit hoher Durchlässigkeit zwischen 650 nm und 750 nm wäre beispielsweise der ATTO 647N eine sehr gute Wahl. Wie aus der Liste der ATTO-Farbstoffe ersichtlich ist, weist ATTO647N einen hohen Extinktionskoeffizienten bei 635 nm, einer Wellenlänge nahe dem Maximum der Absorptionskurve sowie eine ausgezeichnete Quantenausbeute der Fluoreszenz (ηfl = 65 %) auf.
Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über einige häufig verwendete Anregungsquellen und empfohlene ATTO-Label.
| Lichtquelle | Emissionslinie | Geeigneter Farbstoff |
|---|---|---|
| Quecksilberdampflampe | 365 nm 405 nm 436 nm 546 nm 577 nm |
ATTO 390 ATTO 425, ATTO 430LS ATTO 425, ATTO 430LS, ATTO 465 ATTO 550, ATTO 565 ATTO Rho12, ATTO Rho101, ATTO 590 ATTO Rho13, ATTO 594, ATTO 610, ATTO Rho14 |
| Argon-Ionenlaser | 488 nm 514 nm |
ATTO 488, ATTO 490LS ATTO 514, ATTO 520 ATTO 514, ATTO 490LS, ATTO 520 ATTO 532, ATTO 542 |
| Nd:YAG Laser, frequenzverdoppelt |
532 nm | ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542 ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho11, ATTO Rho12 |
| He-Ne Laser | 633 nm | ATTO 643, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655 |
| Krypton-Ionenlaser | 647 nm 676 nm |
ATTO 643 ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680 ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740 |
| Diodenlaser | 635 nm | ATTO 633, ATTO 643, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655 |
Eigenschaften von Fluoreszenzmarkern
Es ist jedoch zu beachten, dass neben den bereits diskutierten optischen Überlegungen auch andere Faktoren bei der Auswahl eines Labels wichtig sein können, z.B. pH-abhängige optische und chemische Eigenschaften des Farbstoffs, seine Löslichkeit, Photo- und chemische Stabilität, die Größe des Chromophors oder Länge des Linkers etc., die die Anforderungen an die jeweilige Anwendung betreffen bzw. erfüllen. Diese Eigenschaften können für die Eignung von Farbstoffen als Fluoreszenzmarker sehr relevant sein.
Am wichtigsten ist, dass der Farbstoff während der Bestrahlung intakt bleibt. Viele gängige Label, wie z.B. das Fluoresceinderivat FITC, weisen eine sehr geringe Lichtstabilität auf. Infolgedessen sind Empfindlichkeit und Qualität der Bildgebung bei Verwendung hochintensiver Laseranregung begrenzt wenn Prozesse über einen längeren Zeitraum beobachtet werden. Dies ist ein gravierender Nachteil bei der Mikroskopie und anderen Techniken, die auf dem konfokalen Prinzip basieren, wie z.B. bei der Detektion von einzelnen Zellen. Im Gegensatz zu einigen weit verbreiteten älteren Farbstoffen sind die neuen patentierten ATTO-Label so konzipiert, dass sie auch bei längerer Bestrahlung wesentlich stabiler sind.
Photostabilität von ATTO 655 im Vergleich zu herkömmlichem Cy5TM in Wasser.
Bestrahlung mit einer 250 W Wolfram-Halogenlampe, fokussiert in eine 1 cm Zelle.
Extinktion vs. Bestrahlungsdauer.
Viele gängige Fluoreszenzmarker zersetzen sich auch ohne Bestrahlung (d.h. im Dunkeln), insbesondere wenn sie kleinen Ozonkonzentrationen in der Laboratmosphäre ausgesetzt sind. Unter identischen Bedingungen der Ozonbelastung sind die Farbstoffe ATTO 647N und ATTO 655 bis zu 100-mal länger stabil als die Cyaninfarbstoffe Cy5TM und Alexa647TM. Dies ist sehr wichtig bei Microarray-Anwendungen, bei denen sich die Farbstoffmoleküle auf der Oberfläche befinden und somit direkt der Atmosphäre ausgesetzt sind.
Kompakte und leistungsstarke Laserdioden decken heute den gesamten sichtbaren und nahen infraroten Teil des Spektrums ab. Sie fanden ihren Weg in viele Anwendungen/Geräte als sehr effiziente Anregungsquellen und ersetzen immer mehr klassische Lichtquellen.
Steht kein Label mit einem Absorptionsmaximum zur Verfügung, das genau der Wellenlänge der vorhandenen Anregungsquelle entspricht, sollte ein Farbstoff mit etwas längerer Wellenlänge gewählt werden. Die Absorption wird dann etwas geringer sein, aber der größere Unterschied zwischen Anregungswellenlänge und dem Fluoreszenzspektrum, welches unabhängig von der Anregungswellenlänge ist, hat bei der Detektion den Vorteil einer besseren Abtrennung von gestreutem Anregungslicht.