R(0)-Werte (FRET)

Eine aktualisierte Tabelle des kritischen Abstands R₀ für die  Energieübertragung (FRET) zwischen ATTO-Farbstoffen steht Ihnen zum Download zur Verfügung.
 

R(0)-Werte.pdf  (13.11.2018)

Diese Tabelle soll Ihnen die Auswahl von Farbstoffpaaren für FRET-Anwendungen erleichtern.

Die Werte der Tabelle wurden mit der von Förster angegebenen Beziehung, unter Verwendung spektroskopischer Daten, die durch Messung verdünnter wässriger Farbstofflösungen erhalten wurden, berechnet. Es wurde eine räumlich statistische Orientierung der Farbstoffmoleküle (κ² = 2/3) und als Brechungsindex der Wert 1,333 (Wasser) angenommen.

In der Theorie von Förster werden die Farbstoffmoleküle (genauer: die für Absorption und Emission verantwortlichen Oszillatoren) als sogenannte Punktdipole angenähert, d.h. sie werden als klein relativ zum Abstand der Moleküle angenommen. In Wirklichkeit handelt es sich keinesfalls um "Punkt"-Dipole, da bei typischen Farbstoffen der Durchmesser eines Farbstoff-Chromophors 10 – 15 Å beträgt. Er ist damit nicht "klein“ relativ zu typischen R₀-Werten von 50 – 70 Å.

Die für die Berechnung der R₀-Werte zugrundegelegte statistische Orientierung von Energie-Donor und Akzeptor ist z.B. in einer einfachen Lösung der Farbstoffe gegeben. Bei Kopplung der Farbstoffmoleküle an Protein, DNA etc. kann jedoch die relative Orientierung von Donor und Akzeptor stark von der statistischen Verteilung abweichen. Im Extremfall kann der Richtungsfaktor κ² die Werte 0 und 4 annehmen. Damit ergibt sich – ganz unabhängig vom Farbstoff – für den kritischen Abstand R₀ der Wert 0 bzw. ein um den Faktor [4/(2/3)]^1/6 = 1,35 höherer Wert als in der Tabelle angegeben.

Der für die Berechnung der Tabellenwerte zugrundegelegte Brechungsindex 1,333 gilt für eine einfache Lösung der Farbstoffe in Wasser. Da die Polarisierbarkeit von Proteinen, DNA etc. im Allgemeinen größer ist, müsste eigentlich bei FRET an Farbstoff-Konjugaten ein etwas höherer Wert für den Brechungsindex eingesetzt werden. Damit verringert sich wiederum der Wert des kritischen Abstandes um einen Betrag, der stark vom jeweiligen Fall abhängt.

Weiterhin ist bei der Beurteilung berechneter R₀-Werte zu berücksichtigen, dass die Präzision von Fluoreszenzdaten (Quantenausbeute, Spektrum) im Allgemeinen deutlich geringer ist, als man gemeinhin annimmt. Darüber hinaus werden für die Berechnung der R₀-Werte die optischen Eigenschaften der Farbstoffe mit freier Carboxylgruppe herangezogen. Die Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften können jedoch für einen Farbstoff, der beispielsweise an ein Protein gebunden ist, deutlich von denen des ungebundenen Farbstoffs abweichen. Insbesondere die Fluoreszenzquantenausbeute kann mitunter drastisch reduziert sein. Aus den genannten Gründen ist eine exakte Übereinstimmung berechneter und experimenteller Daten normalerweise überhaupt nicht zu erwarten. Die Werte der Tabelle wurden auf ganze Å gerundet.